Minyak Atsiri

1.      Kimia dan Penyebarannya

Pada minyak atsiri yang bagian utamanya terpenoid, biasanya terpenoid itu terdapat pada fraksi atisri yang tersuling uap. Zat inilah penyebab wangi, harum, atau bau yang khas pada banyak tumbuhan. Secara ekonomi senyawa tersebut penting sebagai dasar wewangian alam dan juga untuk rempah-rempah serta sebagai senyawa cita rasa di dalam industri  makanan. Suku tumbuhan yang kaya akan minyak atsiri ialah suku Compositae, Matricaria, Labiatae; misalnya Mentha spp., Myrtaceae, Eucalyptus, Pinaceae, Pinus, Rosaceae, bunga mawar, Rutaceae, Citrus, dan Umbelliferae, Pimpinella anisum, Carvum carvi, Cuminum cyminum, Anethum, dan lain-lain. Golongan senyawa lainnya mungkin terdapat bersama-sama dengan terpena di dalam minyak atsiri. Misalnya, bau senyawa yang mengandung belerang sudah merupakan hal umum pada tumbuhan suku Cruciferae dalam Alium, Liliaceae.  Terpena juga sering kali terdapat dalam fraksi yang berbau, bersama-sama dengan senyawa aromatik seperti fenilpropanoid.

Secara kimia, terpena minyak atsiri dapat dipilah menjadi dua golongan, yaitu monoterpena dan seskuiterpena, berupa isoprenoid C10 dan C15 yang jangka titik didihnya berbeda (titik didih monoterpena 140-180 , titik didih seskuiterpena > 200 ). Pertama-tama, monoterpena dapat dipilah lebih lanjut menjadi tiga golongan bergantung pada apakah struktur kimianya asiklik (misalnya geraniol), monosiklik (misalnya limonena), atau bisiklik (misalnya α- dan β- pinena).

Dalam setiap golongan, monoterpena dapat berupa hidrokarbon tak jenuh (misalnya limonena) atau dapat mempunyai gugus fungsi dan berupa alkohol (misalnya mentol), aldehida, atau keton (misalnya menton, karvon).

Monoterpena lakton (lebih dikenal sebagai iridoid) dan tropolon dimasukkan juga ke dalam monoterpena karena alasan biosintesis. Contoh suatu monoterpena lakton ialah nepetalakton yang merupakan kandungan bau utama Nepeta cataria, Labiatae, suatu tumbuhan yang mempunyai daya tarik istimewa bagi kucing peliharaan karena baunya itu. Iridoid lain, seperti loganin, menarik perhatian karena merupakan  senyawa antara pada biosintesis alkaloid indol. Contoh suatu tropolon ialah γ-tujaplisin; penyebaran senyawa ini terbatas pada jamur tertentu dan juga dijumpai sebagai kandungan kayu pada Cupressaceae. Struktur berbagai jenis monoterpenoid terdapat pada gambar 1.

Monoterpena sederhana tersebar luas dan cenderung merupakan bagian dari kebanyakan minyak atsiri. Beberapa senyawa, biasa dijumpai bersama-sama dalam minyak daun, terutama α- dan β- pinena, limonena, ∆3 –karena, α-felandrena, dan mirsena. Minyak bunga dan biji cenderung mempunyai monoterpena yang lebih khas. Tetapi, apapun jenis jaringannya, rupanya campuran rumit sudah  merupakan hal yang umum dan bukan perkecualian. Di satu pihak mungkin terdapat sepuluh sampai lima belas komponen yang mudah terdeteksi, sementara di pihak lain mungkin saja masih banyak terpenoid lain yang jumlahnya sesepora.

Secara kimia, seperti monoterpena, seskuiterpena dipilah-pilah berdasarkan kerangka karbon dasarnya. Yang umum ialah asiklik (misalnya farsenol), monosiklik (misalnya bisabolena), atau bisiklik (misalnya β-selinena, karotol). Tetapi, dalam setiap golongan dikenal banyak senyawa yang berbeda. Memang, menurut perkiraan  baru jelas dan termasuk ke dalam kira-kira 200 jenis kerangka. Dan turunan seskuiterpenoid, yaitu asam absisat dan xantinin, patut mendapatkan perhatian khusus karena sifat pengatur tumbuhnya.

Asam absisat, suatu asam seskuiterpena karboksilat yang strukturnya berkaitan dengan struktur karetonoid violasantin, lebih dikenal sebagai hormon utama yang mengendalikan dormansi pada biji tumbuhan terna dan pada kuncup tumbuhan berkayu. Peranan xantinum (yang terdapat dalam Xanthium pennsylvanicum) sebagai antagonis auksin dalam fisiologi tumbuhan, kurang jelas. Tetapi, ia mewakili golongan seskuiterpena yang penting, yang juga berupa senyawa lakton, dan penyebarannya luas dalam compositae. Sifat lain seskuiterpena lakton ini ialah rasanya yang kadang-kadang pahit atau pedas dan kemampuannya untuk berlaku sebagai alergen. Rumus kimia berbagai seskuiterpena yang disebut di atas terlihat pada gambar 2.

Untuk mengisolasinya dari senyawa tumbuhan, sekarang, mono- dan seskuiterpena dipisahkan dengan cara memakai eter, eter minyak bumi, atau aseton. Cara klasik untuk mengisolasi minyak atsiri ialah memisahkannya dari jaringan segar dengan penyulingan uap. Sekarang langkah ini jarang dilakukan karena ada bahaya terbentuknya senyawa jadian pada suhu yang dinaikkan. Terpena dapat mengalami tata susun ulang (misalnya dehidrasi pada alkohol tersier) atau polimerisasi. Keatsirian terpena sederhana mempunyai arti bahwa terpena itu merupakan bahan yang ideal untuk pemisahan dengan kromatografi gas.

Banyak terpena yang berbau harum dan dengan demikian sering kali dapat dikenali langsung dalam sulingan tumbuhan bila terdapat sebagai kandungan utama.

2.      Cara yang dianjurkan untuk mono dan seskuiterpena

a.       Kromatografi gas cair (KGC)

Tidak diragukan lagi bahwa KGC merupakan cara yang terpenting untuk menelaah minyak atsiri karena dengan sekali kerja KGC memungkinkan analisis kualitatif dan kuantitatif. Hal ini terutama penting bila sejumlah senyawa yang serupa terdapat dalam semua anggota kelompok tertentu; dengan demikian, perbedaan kuantitatiflah yang paling berarti. Sudalah pasti, KGC merupakan alat yang tak tergantikan untuk telaah kemotaksonomi minyak atsiri dalam daun dan kulit, seperti dalam gymnospermae. Suatu pemisahan terpena dalam pinus dengan KGC dilukiskan pada gambar 3.

Untuk mengindentifikasi terpena atsiri dalam suatu bahan tumbuhan, penggunaan KGC harus digabung dengan cara lain, terutama dengan KLT. Misalnya, KLT berguna untuk memantau fraksi yang dipisahkan dengan KGC preparatif; sebaliknya, bila radas KGC preparatif tidak tersedia, pemisahan skala besar dapat dilakukan dengan KLT dipantau dengan KGC. Untuk memastikan identitas, pada waktu lampau, spektrum inframerah minyak atsiri yang telah dipisahkan dibuat secara rutin, tetapi sekarang lebih lazim membuat spektrum massanya karena kebanyakan terpena memberikan pola pecahan yang khas. Dalam hal kritis, baik spektrum inframerah maupun spektrum massa harus ditentukan.

Fraksinasi pendahuluan ekstrak eter kasar  atau ekstrak eter minyak bumi kasar tumbuhan dengan kromatografi kolom asam silikat kadang-kadang menguntungkan karena cara ini mencegah pencemaran kolom KGC oleh pencemar yang bertitik didih tinggi, yang mungkin terdapat dalam ekstrak kasar tersebut. Tetapi, hasil yang memuaskan telah diperoleh di laboratorium ini dengan menkromatografi langsung ekstrak eter kering dari daun atau serbuk biji.

Berbagai jenis fase diam untuk kolom telah digunakan untuk kromatografi minyak atsiri. Barangkali fase nonpolar yang paling populer ialah apiezon L dan silikon SE 30. Fase polar yang paling banyak digunakan ialah poliester dietilena glikol adipat dan carbowax 400. Harus diperhatikan agar bahan penyangga (misalnya Chromosorb W) harus bebas dari sesepora besi, basa atau asam, karena terpena pekat terhadap pencemar yang demikian.

Pada KGC minyak atsiri kasar diperlukan pemrograman suhu agar dapat memisahkan monoterpena, seskuiterpena, dan turunan teroksigenasi lainnya dengan baik. Pada kolom nonpolar hidrokarbon terelusi menurut titik didihnya, tetapi pada kolom jenis lain tidak selalu dapat diperkirakan waktu retensi nisbinya. Beberapa contoh waktu retensi nisbi terlihat pada tabel 1. Ini diberikan untuk memberi gambaran bahwa perlu menggunakan lebih dari satu kolom untuk memisahkan dan mengindentifikasi terpena. Jadi, pasangan senyawa yang berkaitan (misalnya ∆3-karena dan α- felandrena) tidak dapat dipisahkan pada satu  kolom (Apiezon N), tetapi dapat dipisahkan pada kolom lain (polietilen glikol). Pada analisis terinci sudah menjadi kebiasaan untuk menggunakan beberapa kolom berjangka kepolaran tertentu untuk mengindentifikasi komponen minyak atsiri suatu bahan tumbuhan. Ketika menelaah keragaman susunan minyak atsiri dalam suatu populasi tumbuhan yang terdiri atas  satu jenis, kita harus membatasi analisis dengan hanya memakai satu kolom saja sehingga kita harus mencari dahulu fase cair yang menghasilkan pemisahan yang terbaik.

Pada penelitian taksonomi kimia, perlu diperhatikan bahwa kita dapat langsung menganalisis potongan kecil bahan tumbuhan yang ditempatkan langsung dalam lubang masuk radas KGC. Cara ini telah digunakan dengan baik pada potongan herbarium, yang walaupun telah disimpan pada lembaran kertas selama bertahun-tahun masih menghasilkan cukup minyak atsiri untuk dapat  ditentukan pola susunannya.

Bila kita menjumpai campuran rumit minyak, seperti pada analisa bahan cita rasa, sekarang gabungan KGC-SM telah digunakan secara rutin untuk memisahkan dan mengindentifikasi monoterpenoid. Pemakaian komputer untuk menyimpan data dan menelusur pustaka telah memudahkan pekerjaan ini. Perkembangan terakhir dalam pemisahan tersebut termasuk penggantian kolom kemas dengan kolom terbuka yang dilapisi fase cair. Cara ini disebut kromatografi kapiler.

Tabel 1. Waktu retensi nisbi terpena pada kromatografi cair

Terpena

RRt dalam kolom*
Apriezon N 10 % Polietilena glikol 15 % Polietilena

glikol

bispropionitril 15 %

α-pinena 42 29 30
Kamfena 50 41 44
Β-pinena 63 55 54
3-karena 82 73 67
Mirsena 60 82 88
α-Felandrena 82 82 86
Limonena 100 100 100
Β-Felandrena 97 106 116
ρ-Simena 100 175 232

*RRt nisbi terhadap limonena, pelaksanaan pada suhu tetap 65 , sepanjang kolom 300 cm (dari von Rudloff, 1966)

b.      Kromatografi lapis tipis (KLT)

Seperti telah disebutkan, pada analisis terpena, penggunaan KLT dapat digabungkan dengan KGC secara menguntungkan karena keduanya saling melengkapi. Bahkan, bila radas KGC tidak tersedia, kita masih dapat menganalisa minyak atsiri dengan memakai KLT sebagai cara satu-satunya pemisahan (misalnya Horhammer dkk., 1964). Walaupun ada radas KGC, KLT tetap berguna pada setiap pemisahan dan analisis terpena itu. Bila kita menghadapi seskuiterpenoid yang keatsiriannya rendah, mungkin KLT merupakan cara pilihan.

Silika gel merupakan penyerap yang paling banyak digunakan dengan pengembang seperti benzena, kloroform, benzena-kloroform (1:1), dan benzena-etil asetat (19:1). Untuk analisis terpena yang mengandung oksigen (misalnya karvon) laipsan silika gel jangan diaktifkan dulu sebelum dipakai karena air yang ada membantu pemisahan.

Terpena alkaloid paling baik dipisahkan memakai pelat yang dibacem dengan parafin, dengan pengembang metanol 70%. Pelat silika gel yang telah diaktifkan harus dicelupkan dulu ke dalam larutan parafin 5% dalam eter minyak bumi selama satu menit, kemudian dibiarkan mengering sebelum dipakai. Pengembangnya, metanol 70 %, harus dijenuhkan juga dengan minyak parafin.

Modifikasi lain, untuk memisahkan terpena berdasarkan jumlah ikatan rangkap ialah menggunakan pelat KLT silika gel yang waktu penyaputannya menggunakan bubur silika gel yang dibuat dengan larutan AgNO3 dalam air, sebagai pengganti air. Pengembang yang digunakan untuk pelat silika gel –AgNO3 ialah metilina klorida-kloroform-etilasetat-n-propanol (45:45:4,5:4,5).

Cara umum deteksi ialah menyemprot dengan larutan KMnO4 0,2 % dalam air, antimon klorida dalam kloroform, H2SO4 pekat, atau vanilin-H2SO4. Peraksi terakhir dibuat segar dengan menambahkan 8 ml etanol, sambil didinginkan, ke dalam 0,5 g vanilin dalam 2 ml H2SO4 pekat. Setelah disemprot, pelat dipanaskan pada 100-105  sampai pembentukan warna sempurna. Ada pereaksi yang lebih selektif untuk mendeteksi terpena yang mempunyai ikatan rangkap (uap brom) dan terpena yang mempunyai gugus keton (2,4-dinitrofenilhidrazin). Tanggapan beberapa terpena umum terhadap pereaksi deteksi terlihat pada tabel 2.

Tabel 2. Deteksi monoterpena pada pelat kromatografi lapis tipis.

Terpena Tanggapan terhadap uji
UV Brom 2,4- DNP H2SO4
Limonena - + - Coklat
α-pinena - + - Coklat
Pulegon + + + Kuning
Geraniol - + - Lembayung
Karvon + + + Merah jambu
p-Simena + - - -
α-Terpineol - + - Hijau
1,8-Sineol - - - Hijau

*Keterangan : UV : Periksa dengan sinar UV pendek ; brom ; semprot dengan larutan fluoresein 0,05% dalam air, pelat diuapi brom, bercak kuning pada latar belakang merah ; 2,4-DNP: semprot dengan larutan 2,4-DNP 0,4 g dalam HCl 2 M, bercak kuning pada latar belakan putih; H2S04 pekat : semprot H2SO4 pekat dan panaskan pelat pada 100  selama 10 menit.

Perincian lebih lanjut mengenai KLT minyak atsiri terdapat dalam buku Stahl (1969). Dalam buku tersebut cara yang dapat digunakan untuk memisahkan minyak atsiri dalam kira-kira 70 jenis tumbuhan telah disusun berupa tabel.

c.       Tropolon

Tropolon dapat dipisahkan dengan memisahkan dengan kromatografi kertas atau KLT pada pelat selulosa. Zavarin dkk. (1959) telah menggunakan kertas yang telah dibacem dengan asam fosfat dan memakai pengembang iso-oktana-toluena, sementara  Wachtmeinster dan wickberg (1958) menggunakan kertas yang dibacem dengan etilenadiamina tetra asatat  dan pengembang eter minyak bumi. Tropolon dideteksi dengan larutan FeCl3 1%.

d.      Iridoid

Senyawa monoterpena lakton ini paling sering terdapat dalam tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida. Karena itu, untuk menganalisanya diperlukan cara khusus, misalnya Kkt digunakan secara luas untuk mendeteksinya. Untuk memeriksa iridoid umum dalam bahan tumbuhan, Weiffering (1966) telah memaparkan cara sederhana berdasarkan uji warna Trim Hill (Trim dan Hill, 1951). Jaringan segar satu gram, atau bila perlu, bahan herbarium, dipotomg-potong kecil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan 5 ml HCl 1%. Setelah 3-6 jam maserat dienaptuangkan ke dalam tabung lain yang berisi 1 ml pereaksi Trim-Hill (dibuat dari 10 ml asam asetat, a ml larutan CuSO4. 5 H2O 0,2 % dalam air, dan 0,5 ml HCl pekat). Bila tabung dipanaskan sejenak pada nyala api, akan terjadi warna bila ada iridoid tertentu. Asperulin, aukubin, dan monotropein menghasilkan warna biru, harpagid merah jadam. Iridoid tertentu (katalpin, loganin) tak dapat dideteksi dengan cara ini dengan hanya memberikan reaksi positif dengan pereaksi umum glikosida, misalnya benzidin-trikloroasetat (Duff dkk,. 1965).

Untuk identifikasi yang lebih terinci, 100 mg jaringan kering digerus dengan 100 mg pasir dan ditambahkan 10 ml larutan timbal asetat 2 % dalam air. Setelah disaring, ditambah H2SO4 encer, lalu dipusingkan. Cairannya dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambahkan 50 mg pasir dan 50 mg ‘celite’; airnya diuapkan dengan pemanasan. Sisa diekstraksi semalam dengan 4 ml etanol 96%. Ekstrak dipusingkan dan dipekatkan sampai 0,1 ml. Cuplikan dikromatografi kertas (tabel 3) untuk memeriksa apakah ada iridoid khas. Pereaksi deteksi yang dianjurkan ialah antimon klorida dan anisaldehida H2S04. Dapat juga kita melakukan uji warna Trim-Hill pada kertas bila HCl diganti dengan asam Toluena p-sulfonat dan setelah disemprot kertas dipanaskan dalam lingkungan uap asam asetat (Bate-Smith, 1962).

Pemisahan preparatifiridoid dalam ekstrak tumbuhan dapat dilakukan dengan kromatografi kolom pada selulosa CF-11 memakai elusi n-butanol yang dijenuhkan dengan air atau pada silika gel memakai pengelusi CHCl3-metanol dalam berbagai perbandingan. KCKT dapat dilakukan pada kolom µBondapak C18 memakai fase gerak air-metanol.

Tabel 3. Rf dan Warna Iridoid

Iridoid Rf (x 100) dalam Warna dengan
BAA IsoPrOH-air Antimon klorida Anisaldehida-H2SO4
Asperulin 51 90 Biru Biru
Aukubin 38 78 Coklat Ungu-merah
Katapol 32 79 Coklat Jingga
Harpagid 34 - Coklat ungu Merah
Loganin 63 93 Merah Jingga
Monotropein 33 70 Biru Biru

Pengembang : n BuOH-HOAc-H20 (4:1:5) dan IsoPrOH (3:2)

Penyemprot : antimon klorida 15 % dalam kloroform dan anisaldehida-H2SO4 pekat-etanol (1:1:18); supaya timbul warna harus dipanaskan pada 100  selama 2-5 menit.

e.       Seskuiterpena lakton

Cara umum mendeteksi senyawa ini dalam tumbuhan telah diikhtisarkan oleh Mabry (1970). Daun kering (20 g) dihaluskan dalam pelumat Waring dengan 100 ml CHCl3. Bubur yang diperoleh disaring dan ekstrak diuapkan sampai kering pada tekanan rendah. Sisa dilarutkan dalam etanol 95 % lalu ditambahkan larutan timbal aseta 4%. Larutan di saring dan filtrat dipekatkan. Campuran air minyak diekstraksi dengan CHCL3, ekstrak yang diperoleh dikeringkan, lalu diuapkan. Sisa dianalisis langsung dengan KLT dan RMI.

KLT dilakukan pada silika gel G memakai CHCL3- eter (4:1), benzena-aseton (4:1), kloroform-metanol (99:1), benzena-metanol (9:1), benzena-eter (2:3), atau eter minyak bumi-CHCL3-etil asetat (2:2:1). Lakton dideteksi berupa bercak coklat bila pelat yang telah dikembangkan diletakkan dalam bejana yang berisi kristal iodium. Cara lain, lakton tampak berupa bercak hijau, coklat, kuning, merah, atau biru bila pelat disemprot dengan H2SO4 pekat dan dipanaskan pada 100-110  selama 5 menit. Warna yang terbetuk dapat dipakai untuk menetapkan ciri struktur tertentu pada senyawa lakton (Geissman dan Griffin,1971). Misalnya, xantinin dan kumambrin B secara kimia berkerabat dan keduanya menghasilkan warna merah dengan πmaks 540 nm. Pereaksi penyemprot lain ialah larutan resorsinol 1% dalam metanol-asam fosfat 5% (1:1) (Drozdz dan Blosyk, 1978) dan vanilin-H2SO4 (Picman dkk., 1980) yang telah dikembangkan untuk mendeteksi lakon ini secara selektif.

Untuk memantau pemurnian sekuiterpena lakton mungkin pemakaian KCKT bersama KLT bermanfaat. Misalnya, pada isolasi senyawa lakton yang pahit dari akar Chicorium intybus, kami menemukan bahwa pemisahannya dapat dilakukan denan abik bila dielusi isokratik dari kolom Partisil memakai CHCl3-metanol (19:1) yang dipantau pada 254 nm.

Tidak semua senyawa lakton menunjukkan serapan UV yang seperti laktukin dan laktupikrin dalam Chicorium intybus, dan karena itu, mungkin pada kasus lain harus digunakan panjang gelombang yang lebih pendek. Misalnya, pada pemisahan lakton dalam jenis Parthenium pada kolom Ultrasphere-ODS dengan alusi landaian memakai asetonitril-air, Marchand dkk. (1983) mendeteksi lakton dalam eluat pada panjang gelombang 215 nm. KCKT dapat dipakai untuk pemisahan skala besar, tetapi pada umumnya, kromatografi baku pada lapisan tebal atau kolom silika gel biasanya cukup memuaskan. Kemudian, lakton diidentifikasi terutama berdasarkan titik leleh, putaran optik, RMI, dan spektrum massa.

f.       Asam absisat

Cara khusus telah diciptakan untuk mendeteksi dan memperkirakan asam absisat, suatu senyawa seskuiterpena penghambat tumbuh. Suatu contoh (Little dkk., 1972) dimulai dengan ekstraksi jaringan segar memakai metanol 80%, ekstrak disaring, lalu diuapkan, setela diasamkan diekstraksi dengan eter. Setelah itu asam absisat diekstraksi dari eter dengan larutan jenuh NaHCO3, ekstrak dicuci dengan eter dan akhirnya, setelah diasamkan, diekstraksi kembali dengan ter dan eternya diuapkan. Sisa kromatografi pada kertas Whatman 3 MM memakai pengembang isopropanol-amonia-air (8:1:1) dan pita pada Rf 0,5-0,8 dielusi dengan metanol. Kemudoan dikromatografi lagi pada pelat silika gel GF254 memakai pengembang benzena-etil asetat—asam asetat (14:6:1) dan benzena-kloroform-asam format (2:10:1); dengan pengembang terkahir ini pelat yang dikembangkan tiga kali. Asam absisat yang dideteksi berdasarkan pemadaman fluoresensi pelat siliak gel akhirnya dapat dimurnikan dengan sublimasi pada tekanan 0,1 mm sampai suhu 220 .

Cara identifikasi yang paling sederhana ialah dengan KGC pada kolom Chromosorb W 50-60 mesh dengan fase diam QFI 5%; waktu retensi asam absisat, sebagai ester metil, kira-kira 9 menit. Identifikasi KGC dapat dipastikan dengan menyinari senyawa yang diisolasi dengan sinar UV selama 4 jam. Penyinaran ini menghasilkan campuran yang berkesetimbangan antara isomer cis dan isomer buatan trans yang pada KGC memberikan dua puncak, bukan satu puncak seperti sebelumnya (Lenton dkk., 1971). Pemastian identitas lebih abik didasarkan kepada KGC-SM (Gaskin dan MacMillan, 1968). Spektrum UV asam absisat juga merupakan ciri yang berguna pada identifikasinya (πmaks 263 nm dalam asam, 240 nm dalam basa).

Asam absisat murni yang diperoleh dari tumbuhan kadang-kadang tercemari oleh senyawa asam fenolat. Dalam hal demikian, ekstrak kasar dapat dibiarkan terserap oleh kolom PVP (Polycar T). Elusi dengan air akan mengeluarkan senyawa penghambat tumbuh, dan senyawa afenol tetap terjerap pada kolom (Lenton dkk., 1971).

Cara analisis kuantitatif asam absisat terdahulu didasarkan kepada spektropolarimetri (Milborrow, 1967), yang dapat dipakai pada skala µg. Karena serapan UV nya, sekarang akadar asam absisat dapat ditentukan setelah KCKT dengan memantau eluat pada 254 nm. Diperlukan sistem fase balik (misalnya kolom ODS Hypersil) dan elusi secara landaian, mulai dari metanol 10 % sampai metanol 80% dalam asam asetat 0,1 M (Horgan, 1981). KGC-SM memakai baku dalam terdeuterasi dan pemantauan ion terpilih telah dipakai untuk menetukan aras asam absisat pada skala 100 pg dalam daun Eucalyptus yang melayu ( Netting dkk., 1982). Cara uji kebal dapat dipakai juga dengan batas deteksi sekitar 30 pg (Weiler, 1983).

3.      Percobaan laboratorium

a.       Minyak atsiri biji Umbelliferae

Minyak buah Umbelliferae berbau khas yang disebabkan oleh adanya minyak atsiri yang nisbi banyak dalam saluran damar. Akibatnya, buah tersebut banyak digunakan dalam masakan sebagai bahan cita rasa (misalnya mungsi, Carum carvi) atau dalam obat untuk mengobati penyakit kronis yang ringan (misalnya adas, Anethum graveolens). Senyawa yang terdapat dalam minyak atsiri terutama monoterpena, khususnya aldehida (misalnya kumin aldehida) atau keton (misalnya karvon). Kadang-kadang struktur senyawa yang berbau itu agak berbeda, misalnya bau wortel disebabkan oleh 2-nonenal, suatu senyawa turunan hidrokarbon sederhana. Cara KLT sederhana dapat dipakai untuk mengindentifikasi komponen utama dari sejumlah buah Umbelliferae, buah tersebut mudah diperoleh di pasar atau penjual biji-bijian, sehingga percobaan ini menjadi percobaan yang menarik bagi mahasiswa  untuk mendapatkan pengalaman dalam mendeteksi monoterpena pada tumbuhan. Cara sederhana karena jenis tumbuhan yang berbeda menghasilkan KLT yang berbeda; hal ini sangat penting pada farmakognogsi (Betts, 1964).

b.      Langkah kerja

1.      Geruslah beberapa biji menjadi serbuk halus memakai pasir lumpang, dan alu. Rendamlah serbuk dengang eter sekurang-kurangnya setengah jam.

2.      Pekatkan ekstrak eter dan totolkan pada pelat silika gel (rangkap dua). Kembangkan pelat memakai benzena, benzena-kloroform (1:1), atau heksana-kloroform (3:2) (40-60 menit)

3.      Periksalah pelat yang sudah kering dengan sinar UV, apakah ada bercak gelap, bila ada, tandailah.

4.      Semprot satu pelat dengan pereaksi vanilin –H2SO4 dan panaskan pada 100  selama 10 menit agar timbul warna. Semprotlah pelat kedua dengan peraksi 2,4-DNP dan perhatikan apakah ada bercak jingga pada latar belakang kuning pucat.

Contoh hasil pemeriksaan delapan jenis Umbelliferae diberikan pada tabel 4 dan gambar 3. Perhatikan bahwa dalam semua cuplikan terdapat minyak lemak yang menghasilkan garis lengkung pada kira-kira Rf 0,60, tetapi tidak mengganggu deteksi terpena. Disamping kandungan utama seperti yang ditunjukkan pada tabel 4, kebanyakan buah mengandung senyawa lain yang Rf-nya lebih tinggi atau lebih rendah dari Rf kandungan utama. Senyawa yang Rf-nya lebih tinggi adalah monoterpena hidrokarbon seperti limonena (Rf 0,80), α-felandrena, dan α-pinena. Karena keatsiriannya, kita hanya dapat mendeteksi sesepora saja dari senyawa tersebut. Senyawa yang Rfnya lebih rendah terutama seskuiterpena. Percobaan diatas dapat diperluas dengan mengembangkan pelat ketiga dan mengujinya dengan fluoresein dan brom. Suatu hal yang bermanfaat juga bila disediakan cuplikan biji yang ‘tak dikenal’ untuk mahasiswa dan mereka diminta menentukan kandungannya. Beberapa larutan senyawa pembanding terpena murni dalam eter harus dikromatografi juga, berdampingan dengan cuplikan biji. Akhirnya, harus ditekankan kadang-kadang terdapat keragaman antar varietas dalam hal kandungan minyak atsiri dan mungkin saja diperoleh hasil yang berbeda, bergantung pada sumber biji.

Suatu cara yang berguna untuk KLT minyak atsiri, diikuti dengan uji kimia pemastian sederhana pada skala mikro telah diikhtisarkan oleh Ikan (1969). Ia juga merinci bagamana memisahkan kandungan minyak cengkeh dan minyak jeruk, citrus, dengan kromatografi kolom pada silika gel.

Tabel 4. Buah Umbelliferae dan komponen minyak atsirinya *

Nama umum Nama latin Rf (x100)

Kira-kira

Komponen Cara deteksi
Adas manis Pimpinella anisum 71

39

Anetol

Anisaldehida

Jingga, DNP
Mungsi Carum carvi 43 Karvon Jingga, DNP
Ketumbar Coriandri sativum 26 Linalool Merah senduduk, vanilin
Jintan Cuminum cyminum 58 Kuminaldehida Jingga, DNP
Adas anert Anethum graveolens 42 Karvon Jingga, DNP
Adas Foeniculum vulgare 72

38

Anetol

Anisaldehida

Jingga, DNP
Adas sowa Anethum sowa 57

41

Dilapiol

Karvol

Coklat, vanilin

Jingga, DNP

Peterseli Petroselinum cripsum 64 Apiol

Miristisin

Coklat, vanilin

Coklat, vanilin

*pengembang CHCl3-benzena (1:1) pada silika gel.

Leave a Reply